Endotoxinas, el contaminante que sobrevive al autoclave

Hay una idea muy extendida en cualquier laboratorio: si está estéril, está limpio. Para bacterias, hongos y micoplasmas es cierto. Para endotoxinas, no — y esa distinción explica una buena parte de los experimentos que no repiten.

Qué son

Las endotoxinas son lipopolisacáridos (LPS), componentes mayoritarios de la membrana externa de casi todas las bacterias gram-negativas. No son algo que la bacteria fabrique para atacar: son parte de su propia estructura.

Una sola Escherichia coli carga alrededor de dos millones de moléculas de LPS. Las bacterias sueltan pequeñas cantidades al medio mientras crecen, y cantidades grandes cuando mueren.

La molécula tiene dos partes. El lípido A, muy hidrofóbico, la ancla a la membrana bacteriana y es el responsable de casi todos sus efectos biológicos. Unida a él va una cola larga de azúcares, hidrofílica y muy variable entre especies. El peso molecular va de unos 3,000 a 40,000 daltons según el largo de esa cola — y en solución acuosa tienden a formar agregados que pueden rebasar el millón de daltons.

Por qué el autoclave no sirve

Aquí está el punto que da título a esta nota, y viene de una fuente técnica, no de un dicho de pasillo.

Las endotoxinas tienen alta estabilidad térmica. Los ciclos normales de autoclave esterilizan el material de vidrio, pero tienen poco o ningún efecto sobre los niveles de endotoxina que ya estaban ahí. Para destruirlas hace falta bastante más: en la literatura técnica se recomienda someter el vidrio a 250 °C por más de 30 minutos, o a 180 °C durante tres horas.

Con el plástico pasa algo parecido por otro camino. Las temperaturas del moldeo suelen destruir cualquier endotoxina presente en la resina, pero la contaminación puede ocurrir después, durante el ensamble y el empaque. Y la esterilización por radiación gamma o haz de electrones elimina los microbios pero deja las endotoxinas prácticamente intactas.

El resultado es un material que cumple lo que dice su etiqueta —estéril— y que aun así puede aportar endotoxina al experimento. Un estudio que comparó tubos de polipropileno de 50 mL de cuatro fabricantes distintos encontró niveles que iban de 0.007 a 15.0 EU por tubo. Estéril en los cuatro casos.

Cómo se miden

La primera prueba fue la del pirógeno en conejo, de los años cuarenta. Funcionaba, pero era cara, lenta y poco cuantitativa.

En los años setenta apareció la prueba LAL, por Limulus Amebocyte Lysate: el lisado de amebocitos del cangrejo herradura forma un coágulo en presencia de endotoxina. En su versión de gel-clot detecta hasta 0.03 EU/mL, y las versiones turbidimétrica y cromogénica cinéticas llegan a 0.001 EU/mL.

La unidad merece una nota aparte. EU significa Endotoxin Unit, y no es una unidad de peso: una EU equivale a más o menos 0.1 a 0.2 ng/mL, dependiendo del estándar de referencia. La FDA definió unidades de actividad en vez de unidades de masa porque la potencia de una endotoxina depende del largo de su cadena de azúcares, de su estado de agregación, de su solubilidad y de la bacteria de origen. Dos preparaciones con el mismo peso pueden no comportarse igual.

Como referencia práctica, los fabricantes de consumibles para cultivo celular suelen certificar sus productos con un criterio de aceptación de ≤0.10 EU/mL.

Por qué importa aunque no se vea

El material que se contamina con endotoxina no se enturbia, no cambia de color y no huele. El cultivo sigue creciendo. Lo que cambia es lo que las células hacen, y ese cambio se cuela en los datos sin dejar rastro.

Los niveles a los que aparecen efectos documentados son incómodamente bajos:

Tipo de célula	Concentración	Efecto observado
Macrófagos equinos	0.5 ng/mL	Producción de interleucina-6
Anillos aórticos de rata	1 ng/mL	Liberación de TNF e IL-1, contractilidad alterada
Células CHO recombinantes	10 ng/mL	Producción de proteína alterada
Linfomas B murinos	10 ng/mL	Cadenas ligeras de inmunoglobulina, 30 a 40 veces más

El caso de las CHO es el más revelador para quien trabaja con proteínas: niveles de hasta 20 ng/mL no afectaron el crecimiento de siete líneas celulares comunes —incluidas WI-38, 3T3 y CHO— pero entre 10 y 20 ng/mL sí alteraron la producción de proteína recombinante. O sea: el cultivo se veía perfectamente sano y el resultado estaba corrido.

No todas las líneas responden igual. Las que llevan décadas en cultivo pueden haber sido seleccionadas sin querer por resistencia, después de una exposición prolongada a los niveles altos que era común encontrar en medios y sueros antes de que la prueba LAL se generalizara.

De dónde entra

Los cuatro caminos habituales, en orden de frecuencia:

1. El agua. La de destilación y la de ósmosis inversa quitan endotoxina bien, pero los sistemas mal mantenidos —sobre todo los de resinas de intercambio iónico— pueden albergar bacterias que la producen. Y el almacenamiento importa tanto como la purificación: crecen bacterias en los recipientes y las mangueras.
2. Sueros y medios. Hoy la mayoría vienen certificados, pero los componentes que se agregan después de filtrar también aportan.
3. El vidrio. Se adhieren con fuerza y el lavado normal no las quita.
4. El plástico. Por lo que ya se explicó arriba.

Lo que hay que llevarse

Estéril y libre de endotoxina son dos cosas distintas, y sólo una de las dos se resuelve con calor de autoclave. Cuando un experimento con células no repite y todo lo demás está descartado, esta es de las primeras cosas que vale la pena medir — precisamente porque es invisible. Y si el tema es qué tolera el material en el camino y no en el laboratorio, eso lo cubre por qué el liofilizado viaja sin hielo.

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Esta nota trata de control de contaminación en trabajo de laboratorio in vitro. No describe uso en humanos ni en animales.